2025版中國藥典0731蛋白質(zhì)含量測定法內(nèi)容介紹
更新時(shí)間：2025-12-18 | 點(diǎn)擊率：16
組成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈，蛋白質(zhì)是一條或多條多肽鏈組成的生物大分子。不同品種應(yīng)針對自身蛋白質(zhì)特性選擇適宜的測定方法并做相應(yīng)方法學(xué)驗(yàn)證，同時(shí)應(yīng)盡可能選用與待測定品種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相同或相近的蛋白質(zhì)作對照品。本法系依據(jù)蛋白質(zhì)為含氮的有機(jī)化合物，當(dāng)與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時(shí)使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量算出含氮量，再將含氮量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。本法靈敏度較低，適用于0.2～2.0mg氮的測定。氮轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的換算系數(shù)因蛋白質(zhì)中所含氨基酸的結(jié)構(gòu)差異會稍有區(qū)別。供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備，生物制品按如下方法操作。精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末時(shí)，應(yīng)復(fù)溶后量取）適量，用0.9%氯化鈉溶液定量稀釋，制成每1ml中含氮量約1mg的溶液，精密量取1ml，作為總氮供試品溶液進(jìn)行測定。非蛋白氮供試品溶液的制備，除另有規(guī)定外，照附注項(xiàng)下鎢酸沉淀法操作，即得。測定法 除另有規(guī)定外，按測定法（1）操作，生物制品按測定法（2）操作。（1）本測定法適用于不含無機(jī)含氮物質(zhì)及有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的供試品。精密量取各品種項(xiàng)下規(guī)定的供試品溶液適量，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（通則0704第二法或第三法）測定供試品溶液的含氮量。除另有規(guī)定外，氮轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25。（2）本測定法適用于添加無機(jī)含氮物質(zhì)及有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的供試品。除另有規(guī)定外，精密量取各品種項(xiàng)下規(guī)定的總氮及非蛋白氮供試品溶液適量，分別置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（通則0704第二法或第三法）測定，以總氮量減去非蛋白氮量即為供試品溶液的含氮量。除另有規(guī)定外，氮轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25。鎢酸沉淀法 精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末時(shí)，應(yīng)復(fù)溶后量取）適量（蛋白質(zhì)含量不高于0.2g），置20ml量瓶中，加水10ml，加10%鎢酸鈉溶液2.0ml, 0.33mol/L硫酸溶液2ml，加水至刻度。或精密量取上述供試品2ml，加水14.0ml、10%鎢酸鈉溶液2.0ml、0.33mol/L硫酸溶液2.0ml，搖勻，靜置30分鐘，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得（可依據(jù)蛋白質(zhì)濃度適當(dāng)調(diào)整10%鎢酸鈉溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量，使鎢酸終濃度保持1%）。三氯醋酸沉淀法 精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末時(shí)，應(yīng)復(fù)溶后量取）適量（蛋白質(zhì)含量6～12mg），加等體積的10%三氯醋酸溶液，混勻，靜置30分鐘，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得（可依據(jù)蛋白質(zhì)濃度適當(dāng)調(diào)整10%三氯醋酸溶液用量，使三氯醋酸終濃度保持5%）。本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法靈敏度高，測定范圍為20～250μg。但對本法產(chǎn)生干擾的物質(zhì)較多，對雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生干擾的離子，同樣容易干擾福林酚反應(yīng)，且影響更大。如還原物質(zhì)、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。除另有規(guī)定外，按方法1操作；如有干擾物質(zhì)時(shí)，除另有規(guī)定外，按方法2操作并需經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證。試劑 堿性銅試液 取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。對照品貯備液的制備 除另有規(guī)定外，取牛血清白蛋白對照品或蛋白質(zhì)含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并制成每1ml中含0.2mg的溶液。供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備（蛋白質(zhì)濃度應(yīng)與對照品溶液基本一致）。測定法 精密量取對照品貯備液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（對照品貯備液取用量可在本法測定范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），分別置具塞刻度試管中，各加水至1.0ml，得到系列對照品溶液。再分別加入堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘，各加入福林酚試液[取福林試液中的貯備液（2mol/L酸濃度）1→16]4.0ml，立即混勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在650nm的波長處測定吸光度；同時(shí)以0號管作為空白。以系列對照品溶液的濃度與其相對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定。從線性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。測定前將脫氧膽酸鹽-三氯醋酸加入樣品中，通過將蛋白質(zhì)沉淀來去除干擾物質(zhì)。這種方法也可用于將稀溶液中的蛋白質(zhì)濃集。試劑 試液A 取1%氫氧化鈉溶液200ml與5%碳酸鈉溶液200ml混合，加水稀釋至500ml。試液B 取2.98%二水合酒石酸二鈉溶液100ml與1.25%硫酸銅溶液100ml混合，加水稀釋至250ml，臨用新制。試液C 取試液A與試液B按50∶1的比例混合，臨用新制。福林酚試液 取福林試液中的貯備液（2mol/L酸濃度）1→2（所配得的福林酚試液應(yīng)滿足以下要求：取供試品溶液1ml，加試液C 5ml和配好的福林酚試液0.5ml，所得溶液的pH值應(yīng)為10.3±0.3。若溶液pH值超出范圍，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整福林酚試液的稀釋倍數(shù)）。去氧膽酸鈉試液 取去氧膽酸鈉適量，加水制成每1ml中含1.5mg的溶液。對照品溶液的制備 除另有規(guī)定外，取牛血清白蛋白對照品或蛋白質(zhì)含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水分別制成每1ml中含0mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg的溶液（對照品溶液濃度可在本法測定范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整）。供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備（蛋白質(zhì)濃度應(yīng)與對照品溶液基本一致）。測定法 精密量取各對照品溶液1.0ml，分別置玻璃試管中，加入去氧膽酸鈉試液0.1ml，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，加入72%三氯醋酸溶液0.1ml，渦旋混勻，在3000g條件下離心30分鐘，輕輕倒出上清液，用吸管將剩余液體移除。蛋白質(zhì)沉淀用試液C 1ml復(fù)溶后，再加入試液C 5ml，混勻，室溫放置10分鐘，加入福林酚試液0.5ml，立即混勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在750nm的波長處測定吸光度；同時(shí)以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液1.0ml，同法測定。從線性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法快速、靈敏度低，測定范圍通常可達(dá)1～10mg。本法干擾測定的物質(zhì)主要有硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和某些氨基酸等。試劑 雙縮脲試液 取硫酸銅1.5g、酒石酸鉀鈉6.0g和碘化鉀5.0g，加水500ml使溶解，邊攪拌邊加入10%氫氧化鈉溶液300ml，用水稀釋至1000ml，混勻，即得。對照品貯備液的制備 除另有規(guī)定外，取牛血清白蛋白對照品或蛋白質(zhì)含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并制成每1ml中含10mg的溶液。供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備（蛋白質(zhì)濃度應(yīng)與對照品溶液基本一致）。測定法 精密量取對照品貯備液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（對照品貯備液取用量可在本法測定范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），分別置具塞刻度試管中，各加水至1.0ml，得到系列對照品溶液。再分別加入雙縮脲試液4.0ml，立即混勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在540nm的波長處測定吸光度；同時(shí)以0號管作為空白。以系列對照品溶液的濃度與其相對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法操作。從線性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。第四法 2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二羧酸法（BCA法）本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子在堿性溶液中將Cu2+還原為Cu+，2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二羧酸（BCA）與Cu+結(jié)合形成紫色復(fù)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法靈敏度較高，測定范圍可達(dá)80～400μg。本法測定的供試品中不能有還原劑和銅螯合物，否則干擾測定。試劑 銅-BCA試液 取2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二羧酸鈉1g，無水碳酸鈉2g，酒石酸鈉0.16g，氫氧化鈉0.4g與碳酸氫鈉0.95g，加水使溶解成100ml，調(diào)節(jié)pH值至11.25，作為甲液；另取4%硫酸銅溶液作為乙液。臨用前取甲液100ml，加入乙液2ml，混勻，即得。對照品貯備液的制備 除另有規(guī)定外，取牛血清白蛋白對照品或蛋白質(zhì)含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并制成每1ml中含0.8mg的溶液。供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備（蛋白質(zhì)濃度應(yīng)與對照品溶液基本一致）。測定法 精密量取對照品貯備液0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml（對照品貯備液取用量可在本法測定范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），分別置具塞刻度試管中，各加水至0.5ml，得到系列對照品溶液。再分別加入銅-BCA試液10.0ml，立即混勻，置37℃水浴中保溫30分鐘，放冷，照紫外-可見分光光度法（通則0401），立即在562nm的波長處測定吸光度；同時(shí)以0號管作為空白。以系列對照品溶液的濃度與其相對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定。從線性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。第五法 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）本法系依據(jù)在酸性溶液中考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)分子中的堿性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法靈敏度高，通常可測定1～200μg的蛋白質(zhì)量。本法主要的干擾物質(zhì)有去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等，供試品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會影響顯色。試劑 酸性染色液 取考馬斯亮藍(lán)G250 0.1g，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀釋至1000ml，混勻。濾過，取濾液，即得。本試劑應(yīng)置棕色瓶內(nèi)，如有沉淀產(chǎn)生，使用前需經(jīng)濾過。對照品貯備液的制備 除另有規(guī)定外，取牛血清白蛋白對照品或蛋白質(zhì)含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備（蛋白質(zhì)濃度應(yīng)與對照品溶液基本一致）。測定法 精密量取對照品貯備液0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml（對照品貯備液取用量可在本法測定范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），分別置具塞刻度試管中，各加水至0.1ml，得到系列對照品溶液。再分別加入酸性染色液5.0ml，立即混勻，照紫外-可見分光光度法（通則0401），立即在595nm的波長處測定吸光度；同時(shí)以0號管作為空白。以系列對照品溶液的濃度與其相對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定，從線性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。【附注】本法測定時(shí)不可使用可與染色物結(jié)合的比色皿（如石英比色皿），建議使用玻璃比色皿或其他適宜材料的比色皿。本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280nm波長處具最da吸光度，在一定范圍內(nèi)其吸光度大小與蛋白質(zhì)濃度呈正比。本法操作簡便快速，適用于純化蛋白質(zhì)的檢測，一般供試品濃度為0.2～2mg/ml。本法準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多。測定法（2）適用于供試品溶液中存在核酸時(shí)的蛋白質(zhì)測定。對照品溶液與供試品溶液的制備 照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備。測定法 （1）取供試品溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在280nm的波長處測定吸光度，以吸收系數(shù)法或?qū)φ掌繁容^法計(jì)算供試品中蛋白質(zhì)的含量。（2）取供試品溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在280nm與260nm的波長處測定吸光度，按下式計(jì)算供試品中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260
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